Proteinase K NGS (serbuk)
No Cat: HC4507A
NGS Protease K ialah protease serine yang stabil dengan aktiviti enzim yang tinggi dan kekhususan substrat yang luas. Enzim ini menguraikan ikatan ester dan ikatan peptida bersebelahan dengan terminal C asid amino hidrofobik, asid amino yang mengandungi sulfur dan asid amino aromatik.Jadi, ia sering digunakan untuk merendahkan protein menjadi peptida pendek.NGS Protease K ialah protease serine tipikal dengan Asp39-Nya69-Ser224triad pemangkin yang unik untuk protease serin, dan pusat pemangkin dikelilingi oleh tunda Ca2+tapak pengikat untuk penstabilan, mengekalkan aktiviti enzim yang tinggi di bawah julat keadaan yang lebih luas.
Spesifikasi
| Penampilan | Serbuk amorfus putih hingga putih pudar, terliofil |
| Aktiviti khusus | ≥40U/mg pepejal |
| DNase | Tiada yang dikesan |
| RNase | Tiada yang dikesan |
| Beban bio | ≤50CFU/g pepejal |
| Sisa asid nukleik | <5pg/mg pepejal |
Hartanah
| Sumber | Album Tritirachium |
| nombor EC | 3.4.21.64(Rekombinan daripada album Tritirachium) |
| Berat molekul | 29kDa (SDS-PAGE) |
| Titik isoelektrik | 7.81 Rajah.1 |
| pH optimum | 7.0-12.0 (Semua melakukan aktiviti tinggi) Rajah.2 |
| Suhu optimum | 65 ℃ Rajah.3 |
| Kestabilan pH | pH 4.5-12.5 (25℃,16j) Rajah.4 |
| Kestabilan terma | Di bawah 50℃ (pH 8.0, 30min) Rajah.5 |
| Kestabilan penyimpanan | Disimpan pada suhu 25 ℃ selama 12 bulan Rajah 6 |
| Penggerak | SDS, urea |
| Perencat | Diisopropil fluorofosfat;benzilsulfonil fluorida |
Keadaan Penyimpanan
Simpan serbuk lyophilized pada -25~-15 ℃ untuk masa yang lama dari cahaya;Selepas pembubaran, aliquot ke dalam jumlah yang sesuai untuk penyimpanan jangka pendek pada 2-8 ℃ dari cahaya atau penyimpanan jangka panjang pada -25~-15 ℃ dari cahaya.
Langkah berjaga-berjaga
Pakai sarung tangan pelindung dan cermin mata semasa menggunakan atau menimbang, dan pastikan pengudaraan yang baik selepas digunakan.Produk ini boleh menyebabkan reaksi alahan kulit dan kerengsaan mata yang serius.Jika terhidu, ia boleh menyebabkan alahan atau gejala asma atau sesak nafas.Boleh menyebabkan kerengsaan pernafasan.
Definisi unit
Satu unit NGS Protease K ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghidrolisis kasein menjadi 1 μmol L-tirosin di bawah keadaan penentuan piawai.
Penyediaan reagen
| Reagen | Pengeluar | Katalog |
| Casein teknikaldaripada susu lembu | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Asid trichloroacetic | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natrium asetat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Asid asetik | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natrium karbonat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosin | Sigma | 93829 |
Reagen I:
Substrat: 1% Kasein daripada larutan susu lembu: larutkan 1g susu lembu kasein dalam 50ml larutan natrium fosfat 0.1M, pH 8.0, panaskan dalam tab mandi air pada suhu 65-70 °C selama 15 minit, kacau dan larutkan, sejukkan dengan air, diselaraskan dengan natrium hidroksida kepada pH 8.0, dan cairkan kepada 100ml.
Reagen II:
Penyelesaian TCA: 0.1M asid trikloroasettik, 0.2M natrium asetat dan 0.3M asid asetik (timbang 1.64g asid trikloroasetat + 1.64g natrium asetat + 1.724mL asid asetik berturut-turut, tambah 50mL air ternyahion, laraskan dengan HCl3 ke dalam 4 HCl 100ml).
Reagen III:
Larutan natrium karbonat 0.4m (berat 4.24g natrium karbonat kontang dan larut dalam 100mL air)
Reagen IV:
Reagen fenol folin: cairkan 5 kali dengan air ternyahion.
Reagen V:
Pencair enzim: 0.1 M larutan natrium fosfat, pH 8.0.
Reagen VI:
Larutan piawai L-tirosin:0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tirosin dilarutkan dengan 0.2M HCl.
Prosedur
1. Hidupkan spektrofotometer UV-Vis dan pilih ukuran fotometrik.
2. Tetapkan panjang gelombang sebagai 660nm.
3. Hidupkan tab mandi air, tetapkan suhu kepada 37℃, pastikan suhu tidak berubah selama 3-5minit.
4. Panaskan substrat 0.5mL dalam tiub emparan 2mL pada mandi air 37℃ selama 10minit.
5. Ekstrak 0.5mL larutan enzim cair ke dalam tiub emparan yang telah dipanaskan selama 10 minit.Tetapkan pelarut enzim sebagai kumpulan kosong.
6. Tambah 1.0 mL reagen TCA sejurus selepas tindak balas.Gaul rata dan masukkan ke dalam tab mandi air selama 30 minit.
7. Larutan tindak balas emparan.
8. Tambah komponen berikut dalam susunan yang ditentukan.
| Reagen | Kelantangan |
| Supernatan | 0.5 mL |
| 0.4M Natrium karbonat | 2.5 mL |
| Reagen fenol folin | 0.5 mL |
9. Gaul rata sebelum mengeram dalam tab mandi air pada suhu 37 ℃ selama 30 minit.
10. OD660telah ditentukan sebagai OD1;kumpulan kawalan kosong: Pencair enzim digunakan untuk menggantikan larutan enzim untuk menentukan OD660sebagai OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Lengkung piawai L-tirosin: 0.5mL larutan L-tirosin kepekatan berbeza, 2.5mL 0.4M Natrium karbonat, 0.5mL reagen fenol Folin dalam tiub emparan 5mL, mengeram dalam 37℃ selama 30minit, mengesan untuk OD660untuk kepekatan L-tirosin yang berbeza, kemudian diperolehi lengkung piawai Y=kX+b, di mana Y ialah kepekatan L-tirosin, X ialah OD600.
Pengiraan
2: Jumlah isipadu larutan tindak balas (mL)
0.5: Isipadu larutan enzim (mL)
0.5: Isipadu cecair tindak balas yang digunakan dalam penentuan kromogenik (mL)
10: Masa tindak balas (min)
Df: Berbilang pencairan
C: Kepekatan enzim (mg/mL)
Angka
Rajah.1 Sisa DNA
| Sampel | Ave C4 | Asid Nukleik Pemulihan(pg/mg) | Pemulihan(%) | Jumlah Nukleik Asid ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O Tanpa RNA | Tidak pasti | — | — | — |
Rajah.2 pH optimum
Rajah.3 Suhu optimum
Rajah 4 Kestabilan pH
Rajah.5 Kestabilan terma
Rajah 6 Kestabilan penyimpanan pada 25℃
