Kit Maxi Plasmid EndoFree

Keadaan penyimpanan

RNaseA hendaklah disimpan pada -30 ~ -15℃ dan diangkut pada ≤0℃ .

Endotoxin Scavenger boleh disimpan pada 2 ~ 8 ℃ selama satu bulan, disimpan pada -30 ~ -15 ℃ untuk penyimpanan jangka panjangdan diangkut pada ≤0 ℃ .

Komponen lain hendaklah disimpan pada suhu bilik (15 ~ 25 ℃) dan diangkut pada suhu bilik.

Komponen

RNaseA:10 mg/ml, digunakan untuk mengeluarkan RNA.

Penampan P1:penimbal suspensi bakteria, tambah RNaseA ke Penampan P1 sebelum penggunaan pertama.

Penampan P2:penimbal lisis bakteria (mengandungi SDS/NaOH).

Penampan P4:penimbal peneutralan.

Pemusnah Endotoksin:berkesan mengeluarkan endotoksin daripada ekstrak plasmid mentah.

Penampan PW:basuh penimbal, tambahkan isipadu etanol yang ditetapkan sebelum penggunaan pertama.

Penampan TB:penimbal elusi.

Lajur Maxi DNA FastPure:lajur penjerapan DNA plasmid.

Tiub Pengumpulan 50 ml:tiub pengumpulan turasan.

Tiub Pengumpulan bebas endotoksin:tiub pengumpulan DNA plasmid.

Bahan Yang Disediakan

Etanol mutlak, isopropanol, 50 ml tiub emparan bawah bulat dan 50 ml bebas endotoksintiub emparan.

Aplikasi

Produk ini sesuai untuk pengekstrakan plasmid berskala besar daripada 150 - 300 ml larutan bakteriadibudayakan semalaman.

Proses Eksperimen

1. Ambil 150 – 200 ml (tidak lebih daripada 300 ml) larutan bakteria yang dikultur semalaman dan sentrifuge padakira-kira 11,000 rpm (12,000 × g) selama 1 – 2 min.Buang supernatan dan kumpulkan bakteria.

Δ Apabila mengumpul lebih daripada 50 ml larutan bakteria, bakteria boleh dikumpul dengan menambah larutan bakteria, sentrifugasi, membuang supernatan dan langkah lain dalam tiub 50 ml yang sama untuk

beberapa kali.

2. Tambah 7.5 ml Penampan P1 (sila semak sama ada RNaseA telah ditambahkan ke Penampan P1) ke dalam emparantiub yang mengandungi bakteria dan campurkan dengan teliti dengan vorteks atau pipetting.

Δ Penggantungan semula bakteria yang lengkap dalam langkah ini adalah penting untuk menghasilkan, dan tidak sepatutnya ada gumpalan bakteria selepas penggantungan semula.Sekiranya terdapat gumpalan bakteria yang tidak dicampur dengan sempurna, ia akan menjejaskan lisis, mengakibatkan hasil dan ketulenan yang rendah.Jika OD600 larutan bakteria ialah 0.65, adalah disyorkan bahawa 7.5 ml Penampan P1 digunakan apabila mengekstrak daripada 150 ml larutan bakteria;apabila OD600 ialah 0.75, 8 ml Penampan P1 hendaklah digunakan dan isipadu Penampan P2 dan P4 hendaklah ditukar dengan sewajarnya.Jika isipadu larutan bakteria dinaikkan kepada 200 ml, adalah disyorkan bahawaisipadu Penampan P1, P2, dan P4 ditingkatkan secara berkadar.

3. Tambah 7.5 ml Penampan P2 ke ampaian bakteria dari langkah 2 dan kacau perlahan-lahan ke atas dan ke bawah selama 6 – 8kali dan eramkan pada suhu bilik selama 4 – 5 min.

Δ Terbalikkan perlahan-lahan untuk sebati.Pusaran akan menyebabkan pemecahan DNA genom, mengakibatkan serpihan DNA genom dalam plasmid yang diekstrak.Pada masa ini, larutan menjadi likat dan lut sinar, menunjukkan bahawa bakteria telah terlisis sepenuhnya.Tempohnya tidak boleh melebihi 5 minit untuk mengelakkan kemusnahan plasmid.Jika penyelesaiannya tidak jelas, mungkin terdapat terlalu banyak bakteria yang terhasillisis tidak lengkap, jadi jumlah bakteria harus dikurangkan dengan sewajarnya.

4. Tambah 7.5 ml Penampan P4 pada ampaian bakteria dari langkah 3 dan serta-merta terbalikkan perlahan-lahan 6 – 8 kali untuk membolehkan larutan meneutralkan sepenuhnya Penampan P2.Pada masa ini, mendakan putih flocculent sepatutnya muncul.Empar pada lebih daripada kira-kira 11,000 rpm (12,000 × g) selama 10 – 15 minit, pipet dengan teliti supernatan ke dalam tiub emparan bawah bulat 50 ml baharu (disediakan sendiri), dan elakkanmenyedut mendakan putih terapung.

Δ Tambah Penampan P4 dan segera terbalikkan untuk sebati.Biarkan tiub berdiri sehingga mendakan putih diedarkan sama rata ke seluruh larutan untuk mengelakkan pengeluaran kerpasan tempatan yang boleh menjejaskan peneutralan.Jika tiada endapan flokulan putih seragam sebelum sentrifugasi dan supernatan tidak jelas selepas sentrifugasi, tiub bolehdisentrifugasi selama 5 minit lagi.

5. Tambah 0. 1 kali ganda isipadu (10% daripada isipadu supernatan, kira-kira 2.2 ml) Penyumbat Endotoksin kepada supernatan dari langkah 4 dan terbalikkan untuk bercampur.Letakkan larutan dalam tab mandi ais atau masukkan ke dalam ais hancur (atau peti sejuk beku) selama 5 minit sehingga larutan berubah daripada keruh kepada jernih dan lutsinar (atau masihsedikit keruh), dan kadangkala campurkan beberapa kali.

Δ Selepas Pembuang Endotoksin dimasukkan ke dalam supernatan, supernatan akan menjadi keruh tetapisupernatan hendaklah menjadi jernih (atau sedikit keruh) selepas disejukkan dalam mandi ais.

6. Selepas supernatan diletakkan pada suhu bilik (>25℃) selama 10 – 15 min, ia akan menjadi keruh keranasuhunya meningkat kepada suhu bilik.Kemudian supernatan hendaklah diterbalikkan untuk bercampur.

Δ Jika suhu bilik lebih rendah atau anda ingin mengurangkan masa pengekstrakan, supernatan boleh diinkubasi dalam tab mandi air 37 ~ 42 ℃ selama 5 – 10 min dan langkah seterusnya boleh dijalankan selepas supernatanmenjadi keruh.

7. Sentrifuge supernatan pada kira-kira 11,000 rpm (12,000 × g) selama 10 minit pada suhu bilik (suhu mestilah >25℃) untuk memisahkan fasa.Fasa berair atas mengandungi DNA manakala lapisan fasa berminyak biru bawah mengandungi endotoksin dan kekotoran lain.Pindahkanfasa akueus yang mengandungi DNA ke tiub baru danbuang lapisan berminyak.

Δ Suhu semasa sentrifugasi mestilah melebihi 25 ℃ kerana pengasingan fasa berkesan tidakberlaku jika suhu terlalu rendah.

Δ Jika pemisahan fasa tidak berkesan, suhu sentrifugasi boleh dilaraskan kepada 30 ℃ danmasa sentrifugasi boleh ditingkatkan kepada 15 min.

Δ Jangan sedut lapisan berminyak biru kerana ia mengandungi endotoksin dan kekotoran lain.

Mekanisme

Peneutralan Lisis Resuspensi

◇ Tambah 7.5 ml Penampan P1

◇ Tambah 7.5 ml Penampan P2

◇ Tambah 7.5 ml Penampan P4

Penyingkiran endotoksin

◇Tambah 0. 1 kali ganda isipadu supernatan Endotoxin Scavenger

Mengikat dan Mencuci

◇ Tambah 0.5 kali ganda isipadu isopropanol

◇ Tambah 10 ml Penampan PW