Kit Mini Pengekstrakan DNA
Kit ini menggunakan sistem penimbal yang dioptimumkan dan teknologi penulenan lajur gel silika, yang boleh memulihkan serpihan DNA 70 bp – 20 kb daripada pelbagai kepekatan TAE atau TBE agarose gel.Lajur penjerapan DNA boleh menjerap DNA secara khusus dalam keadaan garam tinggi.Di samping itu, kit itu boleh secara langsung membersihkan serpihan DNA daripada produk PCR, sistem tindak balas enzimatik atau produk DNA mentah yang diperoleh melalui kaedah lain, dan membuang kekotoran seperti protein, sebatian organik lain, ion garam tak organik dan primer oligonukleotida.Ia boleh memastikan bahawa penulenan boleh diselesaikan dalam masa 10-15min.DNA yang telah disucikan boleh digunakan secara langsung untuk pengikatan, transformasi, pencernaan enzim, transkripsi in vitro, PCR, penjujukan, suntikan mikro, dll.
Keadaan penyimpanan
Simpan pada -15 ~ -25℃ dan angkut pada suhu bilik.
Komponen
| Komponen | (100 rxns) |
| Penampan KDNK | 80 ml |
| Penampan GW | 2 × 20 ml |
| Penampan Elusi | 20 ml |
| Lajur Mini DNA FastPure-G | 100 |
KDNK penimbal:Penampan pengikat DNA.
Penampan GW:Penimbal basuh;tambah etanol mutlak mengikut isipadu yang ditunjukkan pada botol sebelum digunakan.
Penampan Elusi:Elusi.
Lajur Mini DNA FastPure-G:Lajur penjerapan DNA.
Tiub Koleksi 2 ml:Tiub pengumpulan untuk turasan.
Bahan Yang Disediakan
1.5 ml tiub disterilkan, etanol mutlak dan isopropanol (apabila serpihan DNA ≤100 bp, tambah 1 isipadu
isopropanol kepada 1 isipadu gel), mandi air.
Proses Eksperimen
Tambah 80 ml etanol untuk mencairkan Penampan GW seperti yang ditunjukkan pada tag sebelum digunakan, simpan pada suhu bilik.
Mekanisme
1. penyelesaian tindak balas PCR
Skim pengekstrakan gel:Tambah volum yang sama Skim pemulihan penyelesaian tindak balas PCR Penimbal KDNK:Tambah 5 kali ganda volum Penampan
2. KDNK Kira isipadu gel(100 μl bersamaan dengan 100 mg)
Larutkan gel
3. Panaskan pada 50 ~ 55℃
4. Basuh Ikat
Tambah 300 μL KDNK Penampan*
Tambah 700 μL Penampan GW
Tambah 700 μL Penampan GW
5. Elute
Tambah 20 – 30μL Penampan Elusi atau air ternyahion
Nota* Pemulihan cecair tindak balas PCR tanpa langkah ini
Program pengekstrakan gel
1. Selepas elektroforesis DNA untuk memfraksinasi serpihan DNA, keluarkan jalur tunggal serpihan DNA daripada gel agarose di bawah cahaya UV.Adalah disyorkan untuk menggunakan kertas penyerap untuk menyerap kelembapan jelas gel dan meminimumkan saiz hirisan gel dengan mengeluarkan agarose tambahan yang mungkin.Timbang hirisan gel (tanpa tiub microcentrifuge) untuk mengira isipadunya: Isipadu 100 mg gelslice adalah lebih kurang 100 μL, dengan andaian ketumpatan ialah 1g/ml.
2. Tambah KDNK Penampan volum yang sama, eramkan pada 50~55 ℃ selama 7-10 min (mengikut saiz gel, laraskan masa pengeraman sehingga gel larut sepenuhnya).Terbalikkan tiub 2 kali semasa pengeraman.
Δ Penambahan 1-3 jilid KDNK Penampan tidak akan mempengaruhi kecekapan pemulihan DNA.Jika serpihan DNA untuk dipulihkan <100 bp, 3 jilid KDNK Penampan perlu ditambah;apabila kepingan gel telah larut sepenuhnya, tambahkan 1 isipadu isopropanol dan gaul sebati, kemudian teruskan ke langkah seterusnya.
3. Sentrifuge sebentar untuk membawa sampel ke bahagian bawah tiub, masukkan FastPure DNA Mini Columns-G ke dalam Tiub Pengumpulan 2 ml, pindahkan larutan secara berhati-hati secara maksimum sebanyak 700 μL sekali
masa ke lajur penapisan, sentrifuge pada 12,000 rpm (13,800 X g) selama 30-60 saat.
4. Buang turasan dan tambahkan 300 μL KDNK Penampan ke dalam lajur, eramkan pada suhu bilik selama 1 minit, emparan pada 12,000 rpm (13,800 X g) selama 30-60 saat.
5. Buang turasan dan tambah 700 μL Penampan GW (periksa sama ada etanol mutlak telah ditambah terlebih dahulu!) ke dalam lajur, sentrifuge pada 12,000 rpm (13,800 X g) selama 30-60 saat.
Δ Sila tambah Penimbal GW di sekeliling dinding lajur penjerapan, atau tambahkan penutup belakang Penimbal GW dan gaulkannya secara terbalik selama 2 – 3 kali untuk membantu menyiram sepenuhnya garam yang melekat pada dinding tiub.
6. Ulang langkah 5.
Δ Siram dengan Penampan GW dua kali boleh memastikan bahawa garam dikeluarkan sepenuhnya dan menghapuskan kesan pada eksperimen seterusnya.
7. Buang turasan dan sentrifuge lajur kosong pada 12,000 rpm (13,800 X g) selama 2 min.
8. Masukkan lajur ke dalam tiub microcentrifuge 1.5 ml yang bersih, tambah 20 - 30 μL Penampan Elusi ke tengah membran lajur, eramkan selama 2 minit, dan kemudian sentrifuge pada 12,000 rpm (13,800 X g) selama 1 minit.Buang lajur, simpan DNA yang diperolehi pada -20 .
Δ Memindahkan supernatan langkah 8 ke lajur untuk mencairkan semula dan memanaskan Penampan Elusi kepada 55 (apabila serpihan DNA >3 kb) mungkin membantu untuk meningkatkan kecekapan pemulihan.
Program pemulihan produk PCR
Protokol ini boleh digunakan untuk membersihkan serpihan DNA daripada produk PCR, sistem tindak balas enzimatik dan produk mentah DNA lain (termasuk DNA genetik).Penyelesaian ini dengan cekap boleh mengeluarkan pelbagai nukleotida, primer, dimer primer, molekul garam, enzim dan kekotoran lain.
1. Sentrifuge secara ringkas produk PCR, larutan tindak balas enzim, dan produk mentah DNA yang lain.Anggarkan isipadunya dengan pipet dan pindahkan ke dalam tiub 1.5 ml atau 2 ml yang telah disterilkan.Tambah ddH2O sehingga isipadu sehingga 100 μL;manakala untuk DNA genomik dengan kepekatan tinggi, mencairkan kepada 300 μL dengan ddH2O akan membantu meningkatkan kecekapan pemulihan.
2. Tambahkan 5 jilid KDNK Penampan, gaul sebati dengan menyongsangkan atau mempusing.Jika serpihan DNA yang diminati >100 bp, tambahan 1.5 volum (sampel + KDNK Penampan) etanol perlu ditambah.
3. Masukkan semula lajur ke dalam tiub pengumpulan, pindahkan campuran ke dalam lajur, sentrifuge pada 12,000 rpm (13,800 ×g) selama 30 – 60 saat.Jika isipadu larutan campuran ialah >700 µL, masukkan kembali lajur penjerapan ke dalam tiub pengumpulan, pindahkan larutan yang tinggal ke lajur penjerapan, dan emparan pada 12,000 rpm (13,800 × g) selama 30 – 60 saat.
4. Prestasi seterusnya merujuk kepada langkah 5 – 8 daripada program pengekstrakan 08- 1/Gel.
Aplikasi
Pelbagai kepekatan TAE atau TBE agarose gel;Produk PCR, sistem tindak balas enzimatik atau produk DNA mentah lain yang diperoleh melalui pelbagai kaedah.Serpihan yang dipulihkan terdiri daripada70 bp -20 kb.
Nota
Untuk kegunaan penyelidikan sahaja.Bukan untuk digunakan dalam prosedur diagnostik.
1. Tambah 80 ml etanol untuk mencairkan Penampan GW seperti yang ditunjukkan pada tag sebelum digunakan, simpan pada suhu bilik.
2. Jika KDNK Penampan mudah dimendakan semasa penyimpanan suhu rendah, ia boleh diletakkan pada suhu bilik untuk tempoh masa sebelum digunakan.Jika perlu, ia boleh dipanaskan dalam tab mandi air 37 ℃ sehingga mendakan dibubarkan sepenuhnya, dan kemudian ia boleh digunakan selepas mencampurkan.
3. Tetapkan suhu mandi air kepada 50 ~ 55 ℃ lebih awal.
4. Dalam program pengekstrakan 08-1/Gel langkah 1, meminimumkan saiz kepingan gel akan mengurangkan masa pelarutan dengan ketara dan meningkatkan kecekapan pemulihan (DNA terlinear mudah terhidrolisis apabila terdedah secara berterusan pada suhu tinggi).Jangan dedahkan gel DNA kepada UV untuk masa yang lama, kerana cahaya ultraviolet boleh menyebabkan kerosakan DNA.
5. Larutkan gel dalam program pengekstrakan 08- 1/Gel langkah 2 sepenuhnya, jika tidak kecekapan pemulihan DNA akan terjejas dengan serius.
6. Panaskan Penimbal Elusi atau ddH2O kepada 55 ℃ , yang membantu meningkatkan kecekapan elusi DNA.Adalah disyorkan untuk menyimpan DNA dalam eluen 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 – 8.5.
