Premix qPCR SYBR GREEN Universal (Biru)
No Kucing: HCB5041B
Campuran Induk qPCR Biru Universal (Berasaskan Pewarna) ialah pra-penyelesaian untuk penguatan PCR kuantitatif 2×masa nyata yang dicirikan oleh kepekaan dan kekhususan yang tinggi, berwarna biru, dan mempunyai kesan pengesanan penambahan sampel.Komponen teras Taq DNA polymerase menggunakan permulaan panas antibodi untuk menghalang penguatan bukan spesifik secara berkesan akibat penyepuhlindapan primer semasa penyediaan sampel.Pada masa yang sama, formula menambah faktor penggalak untuk meningkatkan kecekapan penguatan tindak balas PCR dan menyamakan penguatan gen dengan kandungan GC yang berbeza (30 ~ 70%), supaya PCR kuantitatif boleh memperoleh hubungan linear yang baik dalam kuantitatif yang luas. wilayah.Produk ini mengandungi Pewarna Rujukan Pasif ROX khas, yang boleh digunakan untuk kebanyakan instrumen qPCR.Ia tidak perlu melaraskan kepekatan ROX pada instrumen yang berbeza.Ia hanya perlu menambah primer dan templat untuk menyediakan sistem tindak balas untuk penguatan.
Komponen
Campuran Master qPCR Biru Universal
Keadaan penyimpanan
Produk dihantar dengan pek ais dan boleh disimpan pada -25℃~-15℃ selama 18 bulan.Ia adalah perlu untuk mengelakkan penyinaran cahaya yang kuat semasa menyimpan atau menyediakan sistem tindak balas.
Spesifikasi
| penumpuan | 2× |
| Kaedah pengesanan | SYBR |
| kaedah PCR | qPCR |
| Polimerase | Taq DNA polimerase |
| Jenis sampel | DNA |
| Peralatan aplikasi | Kebanyakan instrumen qPCR |
| Jenis produk | Premix SYBR untuk PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata |
| Mohon kepada (permohonan) | Ekspresi Gen |
Arahan
1.Sistem Tindak Balas
| Komponen | Volome(μL） | Volome(μL） | Kepekatan Akhir |
| Premix qPCR SYBR GREEN sejagat | 25 | 10 | 1× |
| Primer Hadapan (10μmol/L) | 1 | 0.4 | 0.2μmol/L |
| Primer Terbalik (10μmol/L) | 1 | 0.4 | 0.2μmol/L |
| DNA | X | X | |
| ddH2O | sehingga 50 | sehingga 20 | - |
[Nota]: Campurkan dengan teliti sebelum digunakan untuk mengelakkan buih berlebihan daripada goncangan yang kuat.
a) Kepekatan primer: Kepekatan primer akhir ialah 0.2μmol/L, dan juga boleh dilaraskan antara 0.1 dan 1.0μmol/L mengikut kesesuaian.
b) Kepekatan templat: Jika templat adalah larutan stok cDNA yang tidak dicairkan, isipadu yang digunakan tidak boleh melebihi 1/10 daripada jumlah isipadu tindak balas qPCR.
c) Pencairan templat: Adalah disyorkan untuk mencairkan larutan stok cDNA sebanyak 5-10 kali.Jumlah optimum templat ditambah adalah lebih baik apabila nilai Ct yang diperoleh melalui amplifikasi ialah 20-30 kitaran.
d) Sistem tindak balas: Adalah disyorkan untuk menggunakan 20μL atau 50μL untuk memastikan keberkesanan dan kebolehulangan penguatan gen sasaran.
e) Penyediaan sistem: Sila sediakan di bangku yang sangat bersih dan gunakan petua dan tiub tindak balas tanpa sisa nuklease;adalah disyorkan untuk menggunakan petua dengan kartrij penapis.Elakkan pencemaran silang dan pencemaran aerosol.
2.Program tindak balas
Program Standard
| Langkah kitaran | Temp. | Masa | Kitaran |
| Denaturasi awal | 95 ℃ | 2 min | 1 |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10 saat | 40 |
| Penyepuhlindapan/Pelanjutan | 60 ℃ | 30 saat★ | |
| Peringkat lengkung lebur | Lalai Instrumen | 1 | |
Program Pantas
| Langkah kitaran | Temp. | Masa | Kitaran |
| Denaturasi awal | 95 ℃ | 30 saat | 1 |
| Denaturasi | 95 ℃ | 3 saat | 40 |
| Penyepuhlindapan/Pelanjutan | 60 ℃ | 20 saat★ | |
| Peringkat lengkung lebur | Lalai Instrumen | 1 | |
[Nota]: Program pantas sesuai untuk kebanyakan gen, dan program standard boleh dicuba untuk gen struktur sekunder kompleks individu.
a) Suhu dan masa penyepuhlindapan: Sila laraskan mengikut panjang primer dan gen sasaran.
b) Pemerolehan isyarat pendarfluor (★): Sila tetapkan prosedur eksperimen mengikut keperluan dalam arahan penggunaan instrumen.
c) Lengkung lebur: Program lalai instrumen boleh digunakan secara normal.
3. Analisis Keputusan
Sekurang-kurangnya tiga replika biologi diperlukan untuk eksperimen kuantitatif.Selepas tindak balas, lengkung amplifikasi dan lengkung lebur perlu disahkan.
3.1 Keluk penguatan:
Keluk amplifikasi piawai adalah berbentuk S.Analisis kuantitatif adalah paling tepat apabila nilai Ct jatuh antara 20 dan 30. Jika nilai Ct kurang daripada 10, adalah perlu untuk mencairkan templat dan menjalankan ujian semula.Apabila nilai Ct adalah antara 30-35, adalah perlu untuk meningkatkan kepekatan templat atau isipadu sistem tindak balas, untuk meningkatkan kecekapan amplifikasi dan memastikan ketepatan analisis keputusan.Apabila nilai Ct lebih daripada 35, keputusan ujian tidak boleh menganalisis secara kuantitatif ekspresi gen, tetapi boleh digunakan untuk analisis kualitatif.
3.2 Lengkung lebur:
Puncak tunggal lengkung lebur menunjukkan bahawa kekhususan tindak balas adalah baik dan analisis kuantitatif boleh dilakukan;jika lengkung lebur menunjukkan puncak berganda atau berganda, analisis kuantitatif tidak boleh dilakukan.Lengkung lebur menunjukkan puncak berganda, dan adalah perlu untuk menilai sama ada puncak bukan sasaran adalah dimer primer atau penguatan bukan khusus oleh elektroforesis gel agarose DNA.Jika ia adalah dimer primer, disyorkan untuk mengurangkan kepekatan primer atau mereka bentuk semula primer dengan kecekapan amplifikasi yang tinggi.Jika ia adalah penguatan bukan khusus, sila tingkatkan suhu penyepuhlindapan, atau reka bentuk semula primer dengan kekhususan.
Nota
Sila pakai PPE yang diperlukan, kot makmal dan sarung tangan, untuk memastikan kesihatan dan keselamatan anda！
Produk ini adalah untuk kegunaan penyelidikan SAHAJA！
