Kit PCR langsung tumbuhan
No Kucing: HCR2020A
Kit PCR Langsung Tumbuhan sesuai untuk penguatan langsung daun tumbuhan, biji benih, dsb., dan boleh digunakan untuk penapisan pemprosesan tinggi bagi sampel tumbuhan yang tidak mengandungi polisakarida dan polifenol.Polimerase DNA amplifikasi langsung berdasarkan evolusi yang diarahkan mempunyai toleransi yang lebih baik terhadap perencat PCR dalam tumbuhan.Sementara itu, ia mengekalkan prestasi penguatan yang tinggi, yang sesuai untuk penguatan serpihan DNA dalam lingkungan 5 kb.Penampan Lysis A yang unik dalam kit boleh digunakan untuk melisiskan tisu tumbuhan segar atau beku.Ia mudah dikendalikan dan lysate boleh digunakan sebagai templat untuk penguatan tanpa penulenan.Sistem ini mengandungi agen pelindung yang membolehkan sampel mentah dikuatkan dengan berkesan selepas pembekuan dan pencairan berulang.2 × Plant Direct Master Mix hanya perlu menambah primer dan templat untuk melakukan tindak balas penguatan, dengan itu mengurangkan operasi pemipetan dan meningkatkan daya pengeluaran pengesanan dan kebolehulangan hasil.
Komponen
| Komponen | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Campuran Induk Langsung Tumbuhan | 1.25 ml | 4×1.25 ml |
| Penampan Lisis Langsung Tumbuhan A | 5 ml | 20 ml |
| Penampan Lisis Langsung Tumbuhan B* | 5 ml | 20 ml |
*Penimbal Lisis Langsung Tumbuhan B ialah reagen pilihan, yang digunakan untuk meneutralkan Penampan Lisis Langsung Tumbuhan A untuk memanjangkan masa penyimpanan sampel.Ia boleh digunakan mengikut keadaan sebenar.
Keadaan Penyimpanan
2 × Campuran Induk Langsung Tumbuhan, simpan pada -30 ~ -15℃ dan elakkan pembekuan dan pencairan berulang;Penampan Lisis Langsung Tumbuhan, simpan pada -30 ~ -15℃ atau 2 ~ 8℃.
Proses Eksperimen
Pemprosesan Sampel–Daun Tumbuhan
Kaedah langsung:Adalah disyorkan untuk menggunakan daun muda.Gunakan penebuk lubang dengan diameter tetap 0.5 – 3 mm untuk mendapatkan sampel yang kecil dan seragam, dan kemudian masukkan terus sampel ke sistem PCR (sistem 50 μl disyorkan).Perhatikan, pastikan sampel berada dalam larutan PCR dan bukan pada dinding tiub.Jika PCR langsung digunakan untuk menguatkan serpihan panjang dan sampel kompleks, menggunakan sampel dengan diameter lebih kecil (0.5 – 1 mm) sebagai templat boleh membantu untuk mendapatkan hasil yang lebih baik.
Kaedah lisis pengisaran:Adalah disyorkan untuk menggunakan daun muda.Ambil sehelai daun kecil (kira-kira 1 – 3 mm diameter), letakkan dalam 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, dan kisar sebanyak mungkin (langkah ini boleh dilakukan dengan memerah daun dengan hujung pipet 100 μl. untuk tumbuk sampel) .Jika jumlah tisu daun yang lebih besar digunakan (tidak melebihi 7 mm), tingkatkan isipadu penimbal pencairan kepada 50 μl.Selepas daun dikisar, larutan harus kelihatan hijau.Selepas sentrifugasi ringkas, tambah 1 μl supernatan ke sistem PCR sebagai templat tindak balasc .
Kaedah lisis terma:Adalah disyorkan untuk menggunakan daun muda.Ambil sekeping daun kecil (kira-kira 1 – 3 mm diameter), letakkan dalam 20 μl Penampan Lisis Langsung Tumbuhan A, dan panaskan pada 95°C selama 5 – 10 min.Masa lisis boleh dilanjutkan dengan sewajarnya untuk daun yang sukar untuk lisis (tidak lebih daripada 20 min).Jika jumlah tisu daun yang lebih besar digunakan (tidak melebihi 7 mm), tingkatkan isipadu penimbal pencairan kepada 50 μl.Selepas dipanaskan, sentrifuge sebentar, dan tambah 1 μl supernatan ke dalam sistem PCR sebagai templat tindak balasb.
Pemprosesan Sampel– Benih Tumbuhan
Kaedah lisis pengisaran:Gunakan pisau bedah untuk memotong benih dengan diameter 5 mm, tambahkannya ke dalam 100 μl Penampan Lisis Langsung Tumbuhan A, dan kisar sampel dengan hujung pipet atau alat lain.Vortex sebentar dan biarkan pada suhu bilik selama 3 – 5 min.Pastikan sampel benih terendam dalam penimbal pencairan.Selepas sentrifugasi singkat, tambah 1 μl supernatan ke sistem PCR sebagai templat tindak balas.
Kaedah lisis terma:Gunakan pisau bedah untuk memotong biji dengan diameter 5 mm, tambahkannya ke dalam 100 μl Penampan Lisis Langsung Tumbuhan A, dan panaskan pada 95°C selama 5 – 10 min.Masa lisis boleh dilanjutkan dengan sewajarnya untuk daun yang sukar untuk lisis (tidak lebih daripada 30 min).Selepas pemanasan, sentrifuge sebentar, dan tambah 1 μl supernatan ke sistem PCR sebagai templat tindak balasb.
a.Gunting atau alat lain juga boleh digunakan untuk memotong sampel dengan saiz yang sesuai;jika penebuk atau gunting digunakan semula, ia hendaklah dibersihkan dengan larutan natrium hipoklorit 2% sebelum setiap penggunaan untuk mengelakkan pencemaran silang antara sampel.
b.Pastikan Penampan Lisis Langsung Tumbuhan cair sepenuhnya sebelum digunakan.Jika penimbal adalah likat atau mempunyai mendakan, ia boleh dipanaskan pada 37 ℃ untuk mencairkannya sepenuhnya sebelum digunakan.
c.Isipadu templat dalam sistem tindak balas boleh dilaraskan dengan sewajarnya mengikut perbezaan isipadu bahan tumbuhan dan bahan pelarut yang ditambah.
Penampan Lisis Langsung Tumbuhan
Penampan Lisis Langsung Tumbuhan A yang terkandung dalam produk ini telah dioptimumkan dengan ketat untuk membebaskan genom kebanyakan tisu tumbuhan dan sesuai untuk penyimpanan jangka pendek tumbuhan mentah pada suhu 4 ℃.Jika sampel perlu disimpan untuk jangka masa yang lebih lama (cth, 1 – 2 bulan), adalah disyorkan untuk memindahkan supernatan ke tiub EP baharu dan menyimpannya pada -20 ℃.Untuk menyimpan sampel dengan lebih stabil, tambahkan jumlah yang sama Penampan Lisis Langsung Tumbuhan B ke dalam supernatan yang dipindahkan, gaul rata dan simpan pada -20℃.Masa penyimpanan yang stabil berbeza dengan sampel dan keadaan tumbuhan.
Sistem Tindak Balas
| ddH2O | Kepada 20.0 µl | Kepada 50.0 µl |
| 2 × Campuran Induk Langsung Tumbuhana | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Sampel daun tumbuhan/ekstrak mentah(Rujuk Pemprosesan Contoh) | Cakera daun 0.5 – 3 mm/x µl | Cakera daun 0.5 – 3 mm/x µl |
a.Ia mengandungi Mg2+pada kepekatan akhir 2 mM.
b.Adalah disyorkan untuk menggunakan kepekatan akhir 0.4μM untuk setiap buku asas.Penggunaan primer yang berlebihan akan membawa kepada peningkatan penguatan tidak spesifik.
c.Jumlah sampel yang digunakan boleh diselaraskan mengikut keadaan sebenar.Jumlah yang digunakan dalam satu tindak balas sampel terlisis mentah boleh dilaraskan antara 2% – 20% daripada jumlah isipadu tindak balas.Menggunakan terlalu banyak sampel boleh menyebabkan kegagalan amplifikasi.
Program Reaksi
| Langkah-langkah | Suhu | Masa |
| Denaturasi Awal | 98 ℃ | 5 minit |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10 saat |
| Penyepuhlindapan | 58 ~ 72 ℃ | 15 saat |
| Sambungan | 72 ℃ | 30 saat |
| Sambungan Akhir | 72 ℃ | 5 minit |
a.Denaturasi Permulaan (98℃, 5 min) menggalakkan lisis tisu tumbuhan, membebaskan DNA genom yang boleh digunakan untuk penguatan PCR.Jangan pendekkan masa atau kurangkan suhu.
b.Adalah disyorkan untuk menetapkannya sama dengan nilai Tm primer atau 2 ~ 4℃ lebih tinggi daripada nilai Tm.Polimerase DNA amplifikasi langsung yang digunakan dalam produk ini berbeza daripada polimerase DNA Taq konvensional, dan mempunyai keperluan khas untuk suhu penyepuhlindapan tindak balas; penggunaan suhu penyepuhlindapan yang tinggi dapat mengurangkan penguatan tidak spesifik dan meningkatkan kecekapan penguatan.Untuk templat yang kompleks, penguatan yang cekap boleh dicapai dengan melaraskan suhu penyepuhlindapan dan memanjangkan masa lanjutan.
c.Jika panjang produk amplifikasi ialah ≤1 kb, masa lanjutan ditetapkan pada 30 saat/kb;jika panjang produk amplifikasi ialah >1 kb, masa lanjutan ditetapkan pada 60 saat/kb.
d.Untuk sampel kompleks atau sampel dengan hasil penguatan yang rendah, bilangan kitaran boleh ditingkatkan dengan sewajarnya kepada 40 -50 kitaran.
Aplikasi
Ia terpakai untuk penguatan langsung tisu tumbuhan dan penapisan pemprosesan tinggi bagi sampel tumbuhan yang tidak mengandungi polisakarida dan polifenol.
Nota
Untuk kegunaan penyelidikan sahaja.Bukan untuk digunakan dalam prosedur diagnostik.
1. Untuk penguatan tumbuhan mentah atau penguatan langsung, adalah disyorkan untuk menggunakan DNA genomik yang telah dimurnikan sebagai kawalan positif sebelum memulakan eksperimen untuk memastikan sistem, primer dan operasi adalah betul.
2. Polimerase DNA amplifikasi langsung yang digunakan dalam kit ini mempunyai aktiviti pembacaan pruf yang kuat.Jika pengklonan TA perlu dilakukan, adalah disyorkan untuk memurnikan DNA sebelum menambah adenine.
3. Panduan Reka Bentuk Primer：
a.Adalah disyorkan bahawa tapak terakhir pada hujung 3′ primer hendaklah G atau C.
b.Ketidakpadanan berturut-turut harus dielakkan dalam 8 pangkalan terakhir di hujung 3' buku asas.c.Elakkan struktur penyepit rambut pada hujung 3′ primer.
d.Perbezaan dalam nilai Tm primer hadapan dan primer terbalik hendaklah tidak lebih daripada 1℃ dan nilai Tm hendaklah dilaraskan kepada 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5 disyorkan untuk mengira nilai Tm).
e.Urutan primer tambahan tambahan yang tidak dipadankan dengan templat, tidak boleh disertakan semasa mengira nilai Tm primer.
f.Adalah disyorkan bahawa kandungan GC primer adalah 40% -60%.
g.Pengagihan keseluruhan A, G, C dan T dalam buku asas hendaklah sekata yang mungkin.Elakkan menggunakan kawasan dengan kandungan GC atau AT yang tinggi.
h.Elakkan kehadiran jujukan pelengkap 5 atau lebih bes sama ada dalam primer atau antara dua primer dan elakkan kehadiran jujukan pelengkap 3 atau lebih bes pada hujung 3′ dua primer.
i.Gunakan fungsi NCBI BLAST untuk memeriksa kekhususan primer untuk mengelakkan penguatan tidak spesifik.
