Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG atau UDG) ialah klon rekombinan E.coli dengan berat molekul 25 kDa.Ia memangkinkan pembebasan urasil bebas daripada DNA untai tunggal dan untai dua yang mengandungi urasil, dan tidak aktif terhadap RNA, dan boleh digunakan untuk mencegah pencemaran produk amplifikasi PCR.Prinsip tindakan adalah berdasarkan fakta bahawa jika dUTP digantikan dengan dTTP dalam tindak balas PCR dan produk penguatan PCR yang mengandungi bes dU terbentuk, enzim boleh secara selektif memecahkan ikatan glikosidik bes U dalam untai tunggal dan untai dua. DNA dan merendahkan produk penguatan PCR.
Permohonan yang Disyorkan
Penguatan Pencegahan Pencemaran
Keadaan Penyimpanan
-20°C untuk penyimpanan jangka panjang, hendaklah dicampur dengan baik sebelum digunakan, elakkan kerap beku-cair.
Penimbal storan
20 mM Tris-HCl (pH 8.0) , 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Penstabil, 50% Gliserol.
Definisi Unit
Jumlah enzim yang diperlukan untuk merendahkan 1µg DNA untai tunggal yang mengandungi bes dU dalam 1 jam pada 37°C ialah 1 unit.
Kawalan kualiti
1.Ketulenan elektroforesis SDS-PAGE lebih daripada 98%
2.Kepekaan amplifikasi, kawalan kelompok ke kelompok, kestabilan
3.Selepas 1U UNG dirawat pada suhu 50 ℃ selama 2 minit, templat yang mengandungi U di bawah 103 salinan harus dihina sepenuhnya dan tiada produk penguatan boleh dihasilkan
4.Tiada aktiviti nuklease eksogen
Arahan
| Komponen | Isipadu (μL) | Kepekatan akhir |
| 10 × PCR Buffer (bebas dNTP, Mg²+percuma) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ganti dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Campuran Primera | 2 | 1× |
| templat | - | ＜1μg/tindak balas |
| ddH₂O | Ke 50 | - |
Catatan: a: Jika digunakan untuk qPCR/qRT-PCR, probe pendarfluor perlu ditambah ke dalam sistem tindak balas.Biasanya, kepekatan primer akhir 0.2 μM boleh memberikan hasil yang baik;apabila prestasi tindak balas adalah lemah, kepekatan primer boleh dilaraskan dalam julat 0.2-1 μM.Biasanya, kepekatan probe dioptimumkan dalam julat 0.1-0.3 μM.Eksperimen kecerunan kepekatan boleh dilakukan untuk mencari gabungan primer dan probe yang terbaik.
Nota
1.Enzim UNG boleh digunakan untuk mengeluarkan produk penguatan dUTP yang tercemar daripada sistem tindak balas sebelum tindak balas penguatan PCR, kemudian untuk mengelakkan keputusan positif palsu akibat pencemaran produk.
2.Suhu optimum untuk enzim UNG yang akan digunakan dalam tindak balas PCR antikontaminasi biasanya 50 ℃ selama 2 minit;keadaan penyahaktifan ialah 95 ℃ selama 5 minit.
3.Elakkan pencairan beku yang kerap, dan jangan dedahkan kepada turun naik suhu yang besar.
4.Gen yang berbeza untuk diperkuatkan mempunyai kecekapan penggunaan dUTP yang berbeza dan kepekaan terhadap enzim UNG, oleh itu, jika penggunaan sistem UNG membawa kepada penurunan sensitiviti pengesanan, sistem tindak balas harus diselaraskan dan dioptimumkan, jika anda memerlukan sokongan teknikal, sila hubungi syarikat kita.
