Superstart qPCR Premix plus-UNG
No Kucing: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG ialah reagen khusus yang direka untuk tindak balas kualitatif dan kuantitatif PCR Masa Nyata menggunakan pengesanan berasaskan probe, dibangunkan khusus untuk proses lyophilization.Ia mengandungi enzim permulaan panas baru Hotstart Taq plus (DG), yang mempunyai aktiviti enzim Taq yang dimeterai pada suhu bilik, dengan berkesan menghalang penguatan bukan spesifik yang disebabkan oleh penyepuhlindapan tidak spesifik primer atau pembentukan dimer primer di bawah keadaan suhu rendah, sekali gus meningkatkan kekhususan tindak balas penguatan.Reagen ini menggunakan penimbal khusus qPCR yang dioptimumkan dan sistem antikontaminasi UNG/dUTP untuk mencapai permulaan panas yang pantas, meningkatkan kecekapan dan kepekaan tindak balas qPCR dengan sangat baik.Ia boleh memperoleh lengkung piawai yang baik dalam julat luas kawasan pengkuantitian dan melaksanakan kuantisasi dengan tepat, dengan berkesan menghalang penguatan positif palsu yang disebabkan oleh sisa produk PCR atau pencemaran aerosol.Reagen ini serasi dengan kebanyakan instrumen PCR kuantitatif pendarfluor daripada pengeluar seperti Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad dan Roche dsb., dan mempamerkan kestabilan yang baik dalam bentuk lyophilized.
Komposisi reagen
1. 5×HotstartPremix tambah-UNG (Mg2+percuma) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×lyoprotectant (pilihan)
Keadaan Penyimpanan
Penyimpanan jangka panjang pada -20 ℃;boleh disimpan pada suhu 4 ℃ sehingga 3 bulan.Gaul rata sebelum digunakan danelakkan pembekuan dan pencairan berulang.
Protokol Berbasikal
| Prosedur | Temp. | Masa | Kitaran |
| Pencernaan | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Pengaktifan polimerase | 95 ℃ | 1~5 min | 1 |
| Denatur | 95 ℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Penyepuhlindapan dan Pelanjutan | 56~64 ℃ | 20~60 s | 40-50 |
qPCR Tindak balas Cecair SyPenyediaan batang
|
Komposisi |
Isipadu 25µL |
Isipadu 50µL |
Kepekatan Akhir |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+percuma) (DG) | 5µL | 10µL | 1× |
| 250mM MgCl2 | 0.45µL | 0.9µL | 4.5 mM |
| 4×lyoprotectant1 | 6.25µL | 12.5µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix2 | 1µL | 2µL | 1× |
| DNA templat3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Kepada 25µL | Kepada 50µL | —— |
1. Kepekatan akhir 0.2μM untuk primer biasanya menghasilkan hasil yang baik;apabila prestasi tindak balas lemah, laraskan kepekatan primer dalam julat 0.2-1μM mengikut keperluan.Kepekatan probe biasanya dioptimumkan dalam julat 0.1-0.3μM melalui eksperimen kecerunan untuk mencari kombinasi optimum.
2. Bilangan salinan gen sasaran yang terkandung dalam pelbagai jenis templat berbeza-beza;jika perlu, pencairan kecerunan boleh dilakukan untuk menentukan jumlah penambahan templat yang optimum.
3. Sistem ini boleh dilyophilized;apabila pelanggan menggunakan sistem ini tanpa keperluan pengeringan beku, 4×lyoprotectant boleh ditambah secara terpilih; jika terdapat produk beku-kering yang diperlukan, semasa reagen cecair peringkat pengesahan prestasi produk, ia mesti menambah 4×lyoprotectant untuk memastikan konsistensi dengan komponen sistem lyophilized dan kesan.
Apabila sistem digunakand untuk pengeringan beku, sediakan sistem as berikut:
| Komposisi | 25µL Sistem Tindak Balas |
| 5 ×HotstartPremix tambah-UNG (Mg2+percuma) (DG) | 5µL |
| 250mM MgCl2 | 0.45µL |
| 4×lyoprotectant | 6.25µL |
| 25×Primer-Probe Mix | 1µL |
| ddH2O | Kepada 18~20µL |
* Jika sistem lain untuk pengeringan beku diperlukan, sila rujuk secara berasingan.
Proses Liofilisasiss
| Prosedur | Temp. | Masa | keadaan | Tekanan |
| Pra-pembekuan | 4 ℃ | 30 min | tahan |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 min | Menyejukkan | ||
| -50 ℃ | 180 min | tahan | ||
| Pengeringan Utama | -30 ℃ | 60 min | Pemanasan |
Vakum muktamad |
| -30 ℃ | 70 min | tahan | ||
| Pengeringan Sekunder | 25 ℃ | 60 min | Pemanasan |
Vakum muktamad |
| 25 ℃ | 300 min | tahan |
2. Proses lyophilization di atas adalah untuk rujukan sahaja.Jenis produk yang berbeza dan pengering beku yang berbeza mempunyai parameter yang berbeza, jadi pelarasan boleh dibuat mengikut keadaan sebenarkeadaan semasa penggunaan.
3. Proses lyophilization yang berbeza mungkin sesuai untuk saiz kumpulan yang berbeza dari lyophilizedproduk, jadi pengesahan ujian yang mencukupi mesti dilakukan apabila digunakan untuk pengeluaran berskala besar.
Arahan untuk menggunakan lyophilized serbuk
1. Sentrifuge serbuk lyophilized secara ringkas;
2. Tambah templat asid nukleik pada serbuk terliofil dan tambah air sehingga 25µL;
3. Gaul rata dengan sentrifugasi dan jalankan pada mesin.
Kawalan kualiti:
1. Ujian fungsional: kepekaan, kekhususan, kebolehulangan qPCR.
2. Tiada aktiviti nuklease eksogen, tiada pencemaran endo/eksonuklease eksogen.
Informasi teknikal:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG menggunakan enzim permulaan panas baru yang membolehkan permulaan panas pantas dalam masa 1~5 minit;melalui rumusan penimbal khas ia sesuai untuk tindak balas PCR kuantitatif pendarfluor multipleks.
2. Ia mempunyai kekhususan yang lebih tinggi yang dengan ketara meningkatkan kepekaan pengesanan had PCR kuantitatif pendarfluor, menjadikan lengkung penguatan normalisasi, nilai pendarfluor memperoleh peningkatan yang jelas pada templat kepekatan rendah, sesuai sebagai reagen pengesanan PCR kuantitatif pendarfluor sensitiviti tinggi.
3. Untuk primer dengan suhu penyepuhlindapan yang lebih rendah atau lebih lama daripada serpihan 200bp, kaedah 3 langkah disyorkan.
4. Kecekapan penggunaan dUTP dan kepekaan terhadap enzim UNG berbeza untuk gen sasaran yang berbeza, oleh itu jika menggunakan sistem UNG membawa kepada penurunan sensitiviti pengesanan, sistem tindak balas harus dilaraskan dan dioptimumkan.Jika sokongan teknikal diperlukan sila hubungi syarikat kami.
5. Gunakan kawasan khusus dan pipet sebelum dan selepas amplifikasi, pakai sarung tangan semasa operasi dan gantikannya dengan kerap;jangan buka tiub tindak balas selepas siap PCR untuk meminimumkan pencemaran sampel oleh produk PCR.
