M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase ialah transkripase terbalik yang diperolehi melalui pemeriksaan mutasi gen M-MLV asal dan ekspresi virus leukemia murine Moloney dalam E.coli.Enzim menghilangkan aktiviti RNase H, mempunyai toleransi suhu yang lebih tinggi, dan sesuai untuk transkripsi songsang suhu tinggi.Oleh itu, ia berguna untuk menghapuskan kesan tidak menguntungkan struktur tahap tinggi RNA dan faktor tidak spesifik pada sintesis cDNA, dan mempunyai kestabilan yang lebih tinggi dan keupayaan sintesis transkripsi terbalik.Enzim mempunyai kestabilan yang lebih tinggi dan keupayaan sintesis transkripsi terbalik.
Komponen
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Penampan Tali Pertama (pilihan)
* 5 × First-Strand Buffer tidak mengandungi dNTP, sila tambah dNTP semasa menyediakan sistem tindak balas
Permohonan yang Disyorkan
1.Satu langkah qRT-PCR.
2.Pengesanan virus RNA.
Keadaan Penyimpanan
-20°C untuk penyimpanan jangka panjang, hendaklah dicampur dengan baik sebelum digunakan, elakkan kerap beku-cair.
Definisi Unit
Satu unit menggabungkan 1 nmol dTTP dalam 10 minit pada 37°C menggunakan poli(A)•oligo(dT)25sebagai templat/primer.
Kawalan kualiti
1.Ketulenan elektroforesis SDS-PAGE lebih daripada 98%.
2.Kepekaan amplifikasi, kawalan kelompok ke kelompok, kestabilan.
3.Tiada aktiviti nuklease eksogen, tiada pencemaran endonuklease eksogen atau exonuklease
Persediaan Reaksi untuk Penyelesaian Reaksi Rantaian Pertama
1.Penyediaan campuran tindak balas
| Komponen | Kelantangan |
| Oligo(dT)12-18 Primer atau Primer Rawaka Atau Primer Khusus Genb | 50 petang |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 petang | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Templat RNA | Jumlah RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH tanpa RNase2O | Kepada 10 μL |
Nota:a/b: Sila pilih jenis primer yang berbeza mengikut keperluan percubaan anda.
2.Panaskan pada 65°C selama 5minit dan sejukkan dengan cepat di atas ais selama 2minit.
3.Tambahkan komponen berikut pada sistem di atas kepada jumlah isipadu 20µL dan gaul perlahan-lahan:
| Komponen | Jilid (μL) |
| 5 × Penampan Untai Pertama | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Perencat RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH tanpa RNase2O | Kepada 20 μL |
4.Sila lakukan tindak balas mengikut syarat berikut:
(1) Jika Primer Rawak digunakan, tindak balas hendaklah dijalankan pada 25 ℃ selama 10 minit, dan kemudian pada 50 ℃ selama 30 ~ 60 minit;
(2) Jika Oligo dT atau primer khusus digunakan, tindak balas hendaklah dijalankan pada 50 ℃ selama 30 ~ 60 minit.
5.Panaskan pada 95 ℃ selama 5 minit untuk menyahaktifkan Neoscript Reverse Transcriptase dan menamatkan tindak balas.
6.Produk transkripsi terbalik boleh digunakan secara langsung dalam tindak balas PCR dan tindak balas PCR kuantitatif pendarfluor, atau disimpan pada -20 ℃ untuk masa yang lama.
PCR Rtindakan：
1.Penyediaan campuran tindak balas
| Komponen | penumpuan |
| 10 × PCR Buffer (bebas dNTP, bebas Mg²+) | 1× |
| dNTP (10mM setiap dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polimerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| templata | ≤10% Penyelesaian Tindakbalas Rantaian Pertama (2 μL) |
| ddH2O | Kepada 50 μL |
Nota:a: Jika terlalu banyak larutan tindak balas rantai pertama ditambah, tindak balas PCR mungkin dihalang.
2.Prosedur Tindakbalas PCR
| Langkah | Suhu | Masa | Kitaran |
| Pra-denaturasi | 95 ℃ | 2-5 minit | 1 |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10-20 saat | 30-40 |
| Penyepuhlindapan | 50-60 ℃ | 10-30 saat | |
| Sambungan | 72 ℃ | 10-60 saat |
Nota
1.Sesuai untuk pengoptimuman suhu transkripsi terbalik dalam julat 42℃~55℃.
2.Ia mempunyai kestabilan yang lebih baik, sesuai untuk penguatan transkripsi songsang suhu tinggi.Di samping itu, ia adalah baik untuk cekap melalui kawasan struktur kompleks RNA.Juga, iasesuai untuk pengesanan RT-PCR kuantitatif pendarfluor multipleks satu langkah.
3.Keserasian yang baik dengan pelbagai enzim penguatan PCR dan sesuai untuk tindak balas RT-PCR sensitiviti tinggi.
4.Sesuai untuk tindak balas RT-PCR kuantitatif pendarfluor satu langkah kepekaan tinggi, dengan berkesan meningkatkan kadar pengesanan kepekatan rendah templat.
5.Sesuai untuk pembinaan perpustakaan cDNA.
