RTL Reverse Transcriptase
Transkripase terbalik RTL ialah polimerase DNA yang bergantung kepada templat RNA yang tidak mempunyai aktiviti exonuclease 3'→5' dan mempunyai aktiviti RNase H.Enzim ini boleh menggunakan RNA sebagai templat untuk mensintesis untaian pelengkap DNA, yang boleh digunakan pada sintesis cDNA untaian pertama, terutamanya untuk RT-LAMP (penguatan isoterma pengantara gelung).Berbanding dengan RTL reverse transcriptase 1.0, sensitiviti bertambah baik dengan ketara, kestabilan terma lebih kuat, dan tindak balas pada 65°C lebih stabil.Transkripase terbalik RTL (bebas gliserol) boleh digunakan untuk menyediakan persediaan terliofil, reagen RT-LAMP terliofil dsb.
Definisi Unit
Satu unit menggabungkan 1 nmol dTTP ke dalam bahan boleh mendakan asid dalam 20 minit pada 50°C menggunakan poli(A)•oligo(dT)25 sebagai primer templat.
Komponen
| Komponen | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Bebas Gliserol) (15U/μL) | 0.1 mL | 1 mL | 10 mL |
| Penampan RTL 10×HC | 1.5 mL | 4×1.5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2×1.5 mL | 3×10 mL |
Keadaan Penyimpanan
Pengangkutan di bawah 0°C dan disimpan pada -25°C~-15°C.
Kawalan kualiti
- Aktiviti Baki daripadaEndonuclease:Tindak balas 50 μL yang mengandungi 1 μg λDNA dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 16 jam pada 37 ℃ menunjukkan corak yang sama seperti kawalan negatif oleh elektroforesis gel.
- Aktiviti Baki daripadaExonuclease:Tindak balas 50 μL yang mengandungi 1 μg Hind Ⅲ tercerna λDNA dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 16 jam pada 37 ℃ menunjukkan corak yang sama seperti kawalan negatif oleh elektroforesis gel.
- Aktiviti Baki daripadaNickase:Tindak balas 50 μL yang mengandungi 1 μg supercoiled pBR322 dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37°C menunjukkan corak yang sama seperti kawalan negatif oleh elektroforesis gel.
- Aktiviti Baki daripadaRNase:Tindak balas 10 μL yang mengandungi 0.48 μg RNA MS2 dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37°C menunjukkan corak yang sama seperti kawalan negatif oleh elektroforesis gel.
- E coli gDNA:Diukur denganE colikit pengesanan HCD khusus，15 unit RTL2.0 mengandungi kurang daripada 1E coligenom.
Persediaan Reaksi
Protokol Sintesis cDNA
| Komponen | Kelantangan |
| Templat RNA a | pilihan |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) atau campuran Primer Rawak(60uM) | 2 μL |
| Campuran dNTP (10mM setiap satu) | 1 μL |
| Perencat RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| Penampan RTL 10×HC | 2 μL |
| Air Tanpa Nukleus | Sehingga 20 μL |
Nota:
1) Dos yang disyorkan bagi Jumlah RNA ialah 1ng~1μg
2) Dos mRNA yang disyorkan ialah 50ng~100ng
Termo-berbasikal Syarat untuk rutin reaksi：
| Suhu (°C) | Masa |
| 25 °Ca | 5minit |
| 55 °C | 10minitb |
| 80 °C | 10minit |
Nota:
1) Jika Campuran Primer Rawak digunakan, langkah pengeraman pada 25°C.
2) Jika campuran primer sasaran digunakan, langkah pengeraman pada 55°C selama 10~30minit.
Protokol RT-LAMP
| Komponen | Kelantangan | Kepekatan Akhir |
| Templat RNA | pilihan | ≥10 salinan |
| Campuran dNTP (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| Primer FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| Primer F3/B3 (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| Primer LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| Perencat RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Reaksi |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Reaksi |
| Bst V2 DNA Polimerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksi |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Jumlah 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (atau 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Air Tanpa Nukleus | Sehingga 25 μL | - |
Nota:
1) Campurkan dengan pusaran dan sentrifuge sebentar untuk dikumpulkan.Pengeraman suhu malar pada 65°C selama 1 jam.
2) Kedua-dua penimbal adalah saling beroperasi dan mempunyai komposisi yang sama.
Nota
1.Produk ini akan membentuk pepejal putih apabila disimpan pada -20 °C.Keluarkan dari -20°C dan letakkan di atas ais selama kira-kira 10 minit.Selepas cair, ia boleh digunakan dengan menggoncang dan mencampurkan.
2. Produk cDNA boleh disimpan pada -20°C atau -80°C atau digunakan serta-merta untuk tindak balas PCR.
3.Untuk mengelakkan pencemaran RNase, sila pastikan kawasan eksperimen bersih, dan pakai sarung tangan dan topeng bersih semasa operasi.
