Proteinase K mNGS (cecair)
Proteinase K ialah protease serin yang stabil dengan kekhususan substrat yang luas.Ia merendahkan banyak protein dalam keadaan asal walaupun dengan kehadiran detergen.Bukti daripada kajian struktur kristal dan molekul menunjukkan enzim tergolong dalam keluarga subtilisin dengan triad pemangkin tapak aktif (Asp39-Nya69-Ser224).Tapak utama pembelahan ialah ikatan peptida bersebelahan dengan kumpulan karboksil asid amino alifatik dan aromatik dengan kumpulan alfa amino yang disekat.Ia biasanya digunakan untuk kekhususannya yang luas.Protease K ini direka khas untuk mNGS.Berbanding dengan proteinase K yang lain, ia mengandungi lebih sedikit pencemaran asid nukleik dengan prestasi enzim yang sama, yang boleh memastikan aplikasi mNGS hiliran dengan lebih baik.
Keadaan Penyimpanan
2-8 ℃ selama 2 tahun
Spesifikasi
| Penampilan | Tidak berwarna kepada cecair coklat muda |
| Aktiviti | ≥800 U/ml |
| Kepekatan Protein | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Tiada yang dikesan |
| DNase | Tiada yang dikesan |
| RNase | Tiada yang dikesan |
Hartanah
| nombor EC | 3.4.21.64(Rekombinan daripada album Tritirachium) |
| Titik isoelektrik | 7.81 |
| pH optimum | 7.0- 12.0 Rajah 1 |
| Suhu optimum | 65 ℃ Rajah 2 |
| kestabilan pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Rajah 3 |
| Kestabilan terma | Di bawah 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Rajah 4 |
| Kestabilan penyimpanan | Lebih 90% aktiviti selama 12 bulan pada 25 ℃ |
| Penggerak | SDS, urea |
| Perencat | Diisopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorida |
Aplikasi
1. Kit diagnostik genetik
2. Kit pengekstrakan RNA dan DNA
3. Pengekstrakan komponen bukan protein daripada tisu, degradasi kekotoran protein, seperti DNAvaksin dan penyediaan heparin
4. Penyediaan DNA kromosom melalui elektroforesis berdenyut
5. Western blot
6. Reagen albumin glikosilasi enzimatik dalam diagnosis vitro
Langkah berjaga-berjaga
Pakai sarung tangan pelindung dan cermin mata semasa menggunakan atau menimbang, dan pastikan pengudaraan yang baik selepas digunakan.Produk ini boleh menyebabkan reaksi alahan kulit dan kerengsaan mata yang serius.Jika terhidu, ia boleh menyebabkan alahan atau gejala asma atau sesak nafas.Boleh menyebabkan kerengsaan pernafasan.
Definisi unit
Satu unit (U) ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghidrolisis kasein untuk menghasilkan 1 μmoltirosin seminit di bawah keadaan berikut.
Penyediaan reagen
Reagen I: 1g susu kasein dilarutkan dalam 50ml larutan natrium fosfat 0.1M (pH 8.0), diinkubasi dalam 65-70 ℃ air selama 15 minit, dikacau dan dilarutkan, disejukkan dengan air, diselaraskan dengan natrium hidroksida kepada pH 8.0, dan isipadu tetap 100ml.
Reagen II: 0.1M asid trichloroacetic, 0.2M natrium asetat, 0.3M asid asetik.
Reagen III: 0.4M Na2CO3penyelesaian.
Reagen IV: Reagen Forint dicairkan dengan air tulen selama 5 kali.
Reagen V: Pencairan enzim: 0.1M larutan natrium fosfat (pH 8.0).
Reagen VI: larutan tirosin: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tirosin terlarut dengan 0.2M HCl.
Prosedur
1. 0.5ml reagen I dipanaskan terlebih dahulu kepada 37℃, tambah 0.5ml larutan enzim, gaul rata, dan eramkan pada37 ℃ selama 10 minit.
2. Tambah 1ml reagen II untuk menghentikan tindak balas, gaul rata, dan teruskan pengeraman selama 30minit.
3. Larutan tindak balas emparan.
4. Ambil 0.5ml supernatan, tambah 2.5ml reagen III, 0.5ml reagen IV, gaul rata dan eramkan pada 37℃selama 30 minit.
5. OD660telah ditentukan sebagai OD1;kumpulan kawalan kosong: 0.5ml reagen V digunakan untuk menggantikan enzimpenyelesaian untuk menentukan OD660sebagai OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Lengkung piawai L-tirosin: 0.5mL larutan L-tirosin kepekatan berbeza, 2.5mL Reagen III, 0.5mL Reagen IV dalam tiub emparan 5mL, mengeram dalam 37℃ selama 30minit, mengesan untuk OD660untuk kepekatan L-tirosin yang berbeza, maka diperolehi lengkung piawai Y=kX+b, di mana Y ialah kepekatan L-tirosin, X ialah OD600.
Pengiraan
2: Jumlah isipadu larutan tindak balas (mL)
0.5: Isipadu larutan enzim (mL)
0.5: Isipadu cecair tindak balas yang digunakan dalam penentuan kromogenik (mL)
10: Masa tindak balas (min)
Df: Berbilang pencairan
C: Kepekatan enzim (mg/mL)
Rujukan
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biokim.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Pengklonan Molekul: Manual Makmal, edisi ke-2, Cold Spring HarborAkhbar Makmal, Cold Spring Harbor (1989).
Angka
Rajah.1 Optimum pH
Larutan penimbal 100mM: pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Kepekatan enzim:1mg/mL
Rajah.2 Suhu optimum
Tindak balas dalam penimbal K-fosfat 20 mM pH 8.0.Kepekatan enzim: 1 mg/mL
Rajah.3 pH Kestabilan
25 ℃, 16 h-rawatan dengan larutan penimbal 50 mM: pH 4.5- 5.5, Asetat;pH 6.0-8.0, Na-fosfat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.Kepekatan enzim: 1 mg/mL
Rajah.4 Terma kestabilan
Rawatan 30 minit dengan penimbal Tris-HCl 50 mM, pH 8.0.Kepekatan enzim: 1 mg/mL
Rajah.5 Penyimpanan stability at 25 ℃
