PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) ialah kaedah enzimatik yang paling berkesan untuk menyingkirkan hampir semua oligosakarida berkait N daripada glikoprotein.PNGase F ialah amidase, yang membelah antara kebanyakan GlcNAc dan sisa asparagin dalam mannose tinggi, hibrid dan oligosakarida kompleks daripada glikoprotein berkaitan N.
Permohonan
Enzim ini berguna untuk penyingkiran sisa karbohidrat daripada protein.
Penyediaan dan spesifikasi
| Penampilan | Cecair Tidak Berwarna |
| Ketulenan protein | ≥95% (daripada SDS-PAGE) |
| Aktiviti | ≥500,000 U/mL |
| Eksoglycosidase | Tiada aktiviti dapat dikesan (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Hartanah
| nombor EC | 3.5.1.52(Rekombinan daripada mikroorganisma) |
| Berat molekul | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Titik isoelektrik | 8. 14 |
| pH optimum | 7.0-8.0 |
| Suhu optimum | 65 °C |
| Kekhususan substrat | Membelah ikatan glikosidik antara GlcNAc dan sisa asparagine Rajah.1 |
| Tapak pengiktirafan | Glikan berkait N melainkan mengandungi α1-3 fucose Rajah 2 |
| Penggerak | DTT |
| Perencat | SDS |
| Suhu penyimpanan | -25 ~-15 ℃ |
| Penyahaktifan Haba | Campuran tindak balas 20µL yang mengandungi 1µL PNGase F dinyahaktifkan melalui pengeraman pada 75 °C selama 10 minit. |
Rajah 1 Kekhususan substrat PNGase F
Rajah 2 Kedudukan pengiktirafan PNGase F.
Apabila residu GlcNAc dalaman dikaitkan dengan α1-3 fucose, PNGase F tidak boleh membelah oligosakarida berkaitan N daripada glikoprotein.Pengubahsuaian ini biasa berlaku pada tumbuhan dan beberapa glikoprotein serangga.
Clawan
|
| Komponen | penumpuan |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Penimbal Pendenatur Glikoprotein | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definisi unit
Satu unit(U) ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk mengeluarkan >95% daripada karbohidrat daripada 10 µg RNase B yang didenaturasi dalam 1 jam pada 37°C dalam jumlah isipadu tindak balas 10 µL.
Keadaan tindak balas
1. Larutkan 1-20 µg glikoprotein dengan air ternyahion, tambah 1 µl 10×Penimbal Pendenatur Glikoprotein dan H2O (jika perlu) untuk menghasilkan jumlah padu tindak balas sebanyak 10 µl.
2.Inkubasi pada 100°C selama 10 minit, sejukkan di atas ais.
3.Tambah 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 dan campurkan.
4.Tambah 1-2 µl PNGase F dan H2O (jika perlu) untuk membuat 20 µl jumlah isipadu tindak balas dan campurkan.
5.Inkubasi tindak balas pada 37°C selama 60 minit.
6.Untuk analisis SDS-PAGE atau analisis HPLC.
