mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2' -O-methyltransferase diperoleh daripada strain E. coli rekombinan yang membawa gen untuk vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Enzim ini menambah kumpulan metil pada kedudukan 2'-O nukleotida pertama bersebelahan dengan struktur penutup pada 5'hujung RNA. Enzim ini menggunakan S-adenosylmethionine (SAM) sebagai penderma metil untuk metilasi RNA bertutup -0) menghasilkan struktur cap- 1.

Struktur Cap1 boleh meningkatkan kecekapan terjemahan, meningkatkan ekspresi mRNA dalam eksperimen transfeksi dan suntikan mikro. Enzim ini secara khusus memerlukan RNA dengan penutup m7GpppN sebagai substrat.Ia tidak boleh menggunakan RNA dengan pN, ppN, pppN atau GpppN pada hujung 5'.RNA tertutup boleh disediakan melalui transkripsi in vitro menggunakan analog topi atau melalui penyekat enzimatik menggunakan Enzim Penyekat Vaccinia.

Komponen

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Penimbal Tindak Balas Pembatasan

Penyimpanan

-25 ～- 15 ℃ untuk penyimpanan （ Elakkan kitaran beku-cair berulang）

Penimbal storan

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% gliserol.

Definisi unit

Satu unit ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk metilasi 10 pmoles transkrip RNA bertutup 80 nt dalam 1 jam pada 37°C.

Ujian kawalan kualiti

Exonuclease:50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1μg λ-Hind III mencerna DNA pada 37 ℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi seperti yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarose.

Endonuklease: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1 μg λDNA pada 37 ℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi seperti yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarose.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1μg pBR322 pada 37 ℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi seperti yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarose.

RNase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1.6μg MS2 RNA selama 4 jam pada 37℃ tidak menghasilkan degradasi seperti yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarose.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase disaring untuk kehadiranE. coli DNA genomik menggunakan TaqMan qPCR dengan primer khusus untukE. coli Lokus rRNA 16S.TheE. coli pencemaran DNA genom ialah =1E. coli genom.

Bakteria Endotoksin: Ujian LAL, mengikut Cina Pharmacopoeia IV edisi 2020, kaedah ujian had gel, peraturan am (1143).Kandungan endotoksin bakteria hendaklah =10 EU/mg.

Sistem dan keadaan tindak balas

1. Gabungkan jumlah RNA Capped dan H2O bebas RNase yang sesuai dalam tiub mikrofuge 1.5 mL kepada isipadu akhir 16.0 µL.

2. Panaskan pada 65 ℃ selama 5 minit diikuti dengan mandi ais selama 5 minit.

3. Tambahkan komponen berikut dalam susunan yang ditentukan (untuk metilasi RNA Tertutup

kurang daripada 10

*10× Penampan Tindak Balas Pembatasan : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubasi pada 37℃ selama 1 jam (2 jam pengeraman disyorkan untuk serpihan sasaran kurang daripada 200 nt).

Aplikasi

Untuk meningkatkan ekspresi mRNA semasa microinjection dan eksperimen transfection.

Nota penggunaan

1. Sebelum tindak balas, RNA hendaklah ditulenkan dan dilarutkan dalam air bebas nuklease, semua larutan tidak boleh mengandungi sebarang EDTA dan ion.

2. Adalah disyorkan untuk memanaskan sampel RNA pada 65 ℃ selama 5 minit sebelum tindak balas untuk mengeluarkan struktur sekunder pada 5'hujung transkrip.Ia boleh dilanjutkan kepada 10 minit untuk struktur terminal 5´-kompleks.