M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase diperolehi oleh teknologi kejuruteraan genetik.Ia mempunyai keupayaan sintesis cDNA yang lebih tinggi, kestabilan terma dan had suhu tindak balas (sehingga 60°C).Produk cDNA yang disintesis adalah sehingga 10 kb.Ia meningkatkan pertalian templat dan sesuai untuk transkripsi terbalik templat RNA dengan struktur sekunder yang kompleks atau gen salinan rendah.
Komponen
| Komponen | HC2003B-01 (10,000U) | HC2003B-02 (5*10,000U) | HC2003B-03 (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1.25 mL | 5 mL |
Keadaan Penyimpanan
Produk ini hendaklah disimpan pada -25°C~-15°C selama 2 tahun.
Definisi Unit
Satu unit menggabungkan 1 nmol dTTP ke dalam bahan tidak larut asid dalam 10 minit pada 37°C menggunakan Oligo(dT) sebagai primer.
Persediaan Reaksi
1. Denaturasi templat RNA (Langkah ini adalah pilihan, denaturasi templat RNA membantu membuka struktur sekunder, yang akan meningkatkan hasil cDNA untai pertama.)
| Komponen | Jilid (μL) |
| ddH bebas RNase2O | Ke 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) atau Primer Rawak (50 μmol/L) Atau Primer Khusus Gen (2 μmol/L) | 1 |
| atau 1 | |
| atau 1 | |
| templat RNA | Xa |
Nota:
1) a: Jumlah RNA: 1-5 ug atau mRNA: 1-500 ng
2) Inkubasi pada suhu 65°C selama 5 minit, kemudian pindahkan ke atas ais serta-merta untuk disejukkan selama 2 minit.Sentrifugasi ringkas untuk mengumpul cecair tindak balas, tambah larutan tindak balas transkripsi terbalik seperti yang ditunjukkan dalam jadual berikut.Pipet perlahan-lahan untuk dicampur.
1. Penyediaan campuran tindak balas (isipadu 20 μL)
| Komponen | Jilid (μL) |
| Campuran langkah sebelumnya | 13 |
| 5×Penimbal | 4 |
| Campuran dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Transkripase Terbalik (200 U/μL) | 1 |
| Perencat RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Lakukan tindak balas dalam keadaan berikut:
| Suhu (°C) | Masa |
| 25 °Ca | 5minit |
| 42 °Cb | 15-30minit |
| 85 °Cc | 5minit |
Nota:
1) a.Pengeraman pada 25°C selama 5 minit diperlukan hanya untuk menggunakan heksamer rawak.Sila langkau langkah ini apabila menggunakan Oligo (dT)18atau Primer Khusus Gen.
2) b.Suhu transkripsi terbalik yang disyorkan ialah 42°C, Untuk templat dengan struktur sekunder yang rumit atau kandungan GC yang tinggi, adalah disyorkan untuk menaikkan suhu tindak balas kepada 50-55°C.
3) c.Pemanasan pada 85°C selama 5 minit untuk menyahaktifkan transkripase terbalik.
4) Produk boleh digunakan terus dalam tindak balas PCR atau qPCR, atau disimpan pada -20°C untuk penyimpanan jangka pendek.Adalah disyorkan untuk mengasingkan produk dan menyimpan pada -80°C untuk penyimpanan jangka panjang.Elakkan pencairan beku yang kerap.
5) Produk ini sesuai untuk satu langkah RT-qPCR, disyorkan untuk menambah 10-20 U reverse transcriptase untuk setiap sistem tindak balas 25μL, atau secara beransur-ansur meningkatkan jumlah reverse transcriptase mengikut keadaan sebenar.
Nota
1.Sila pastikan kawasan eksperimen bersih;Sarung tangan dan topeng yang bersih hendaklah dipakai semasa operasi.Semua bahan habis pakai yang digunakan dalam eksperimen hendaklah bebas RNase untuk mengelakkan pencemaran RNase.
2.Semua prosedur hendaklah dilakukan di atas ais untuk mengelakkan degradasi RNA.
3. Sampel RNA berkualiti tinggi disyorkan untuk memastikan kecekapan tinggi transkripsi terbalik.
4.Produk ini adalah untuk kegunaan penyelidikan sahaja.
5.Sila beroperasi dengan kot makmal dan sarung tangan pakai buang, untuk keselamatan anda.
