RNA terkandas dua (dsRNA) KIT ELISA

Kit ini ialah Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) yang digabungkan dengan sistem biotin-Streptavidin, untuk pengukuran kuantitatif dsRNA dengan panjang melebihi 60 pasangan asas(bp), tanpa mengira jujukan.Plat telah disalut dengan antibodi anti-dsRNA.dsRNA yang terdapat dalam sampel ditambah dan mengikat antibodi yang disalut pada telaga.Dan kemudian antibodi anti-dsRNA terbiotinilasi ditambah dan mengikat dsRNA dalam sampel.Selepas mencuci, HRP-Streptavidin ditambah dan mengikat kepada antibodi anti-dsRNA Biotinilated.Selepas pengeraman HRP-Streptavidin yang tidak terikat dihanyutkan.Kemudian larutan substrat TMB ditambah dan dimangkinkan oleh HRP untuk menghasilkan produk warna biru yang berubah menjadi kuning selepas menambah larutan henti berasid.Ketumpatan kuning adalah berkadar dengan jumlah sasaran dsRNA yang ditangkap dalam plat.Penyerapan diukur pada 450 nm.

Permohonan

Kit ini adalah untuk pengukuran kuantitatif bagi sisa dsRNA.

Komponen kit

Penyimpanan dan Kestabilan

1. Untuk kit yang tidak digunakan: Keseluruhan kit boleh disimpan pada 2~8℃ dalam jangka hayat.Cahaya yang kuat harus dielakkan untuk kestabilan penyimpanan.

2. Untuk kit terpakai: Setelah mikroplate dibuka, sila tutup telaga yang tidak digunakan dengan pengedap plat dan kembalikan ke kantung foil yang mengandungi pek bahan pengering, tutup zip kantung foil dan kembalikan kepada 2~8℃ secepat mungkin selepas digunakan.Reagen lain hendaklah dikembalikan kepada 2~8 ℃ secepat mungkin selepas digunakan.

Bahan Diperlukan Tetapi Tidak Dibekalkan

1. Pembaca plat mikro dengan penapis 450±10nm (lebih baik jika boleh mengesan pada panjang gelombang 450 dan 650 nm).

2. Microplate shaker.

3. Petua bebas RNase dan tiub emparan.

Carta Aliran Operasi

Sebelum awak bermula

1. Bawa semua komponen dan sampel kit ke suhu bilik (18-25 ℃) sebelum digunakan.Jika kit tidak akan digunakan dalam satu masa, sila hanya keluarkan jalur dan reagen untuk percubaan sekarang, dan biarkan jalur dan reagen yang tinggal dalam keadaan yang diperlukan.

2. Penimbal basuh: cairkan 40mL penimbal basuh 20× pekat dengan 760mL air ternyahion atau suling untuk menyediakan 800mL penimbal basuh 1×.

3. Standard: putarkan sebentar atau sentrifuge larutan stok sebelum digunakan.Kepekatan empat piawai yang disediakan ialah 5ng/μL.Untuk piawaian UTP dan pUTP dsRNA, sila cairkan larutan stok kepada 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL dengan penimbal STE untuk melukis lengkung piawai.Untuk piawaian dsRNA N1-Me-pUTP, sila cairkan larutan stok kepada 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL dengan penimbal STE untuk melukis lengkung piawai.Untuk piawaian dsRNA 5-OMe-UTP, sila cairkan larutan stok kepada 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL dengan penimbal STE untuk melukis lengkung piawai.Kami mengesyorkan piawaian boleh dicairkan seperti carta berikut:

4. Antibodi pengesanan biotinilasi dan penyelesaian kerja HRP-streptavidin: putarkan sebentar atau sentrifuge larutan stok sebelum digunakan.Cairkan mereka kepada kepekatan kerja dengan penimbal pencairan.

5. Substat TMB: aspirasikan dos larutan yang diperlukan dengan hujung yang disterilkan dan jangan buang sisa larutan ke dalam vial semula.Substate TMB sensitif kepada cahaya, jangan dedahkan substrat TMB kepada cahaya untuk masa yang lama.

Menggunakan protokol

1. Tentukan bilangan jalur yang diperlukan untuk ujian.Masukkan jalur ke dalam bingkai untuk digunakan.Baki jalur plat yang tidak digunakan dalam ujian ini hendaklah dibungkus semula dalam beg dengan bahan pengering.Tutup beg dengan ketat untuk penyimpanan dalam peti sejuk.

2. Tambah 100μL setiap pencairan piawai, kosong dan sampel ke dalam telaga yang sesuai.Tutup dengan pengedap plat.Inkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dengan goncangan pada 500rpm.Sampel hendaklah dicairkan dengan penimbal STE kepada kepekatan yang sesuai untuk ujian yang tepat.

3. Langkah mencuci: Aspirasikan larutan dan basuh dengan penimbal pencuci 250μL ke setiap perigi dan biarkan ia berdiri selama 30s.Buang penimbal basuh sepenuhnya dengan menyentap pinggan pada kertas penyerap.Basuh sepenuhnya 4 kali.

4. Tambahkan 100μL larutan kerja antibodi pengesanan terbiotinilasi ke dalam setiap telaga.Tutup dengan pengedap plat.Inkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dengan goncangan pada 500rpm.

5. Ulangi langkah mencuci.

6. Tambahkan 100μL larutan kerja HRP-streptavidin ke dalam setiap telaga.Tutup dengan pengedap plat.Inkubasi selama 30 minit pada suhu bilik dengan goncangan pada 500rpm.

7. Ulangi langkah mencuci sekali lagi.

8. Tambah 100μL larutan substrat TMB ke dalam setiap telaga.Tutup dengan pengedap plat.Inkubasi selama 30 minit di RT Protect daripada cahaya.Cecair akan bertukar menjadi biru dengan penambahan larutan substrat.

9. Tambah 50μL larutan henti ke dalam setiap perigi.Cecair akan menjadi kuning dengan penambahan larutan henti.Kemudian jalankan pembaca plat mikro dan lakukan pengukuran pada 450nm dengan serta-merta.

Pengiraan Keputusan

1. Purata bacaan pendua untuk setiap piawai, kawalan dan sampel dan tolak purata ketumpatan optik standard sifar.Bina lengkung piawai dengan penyerapan pada paksi menegak(Y) dan kepekatan dsRNA pada paksi mendatar(X).

2. Adalah disyorkan untuk melakukan pengiraan dengan perisian pemasangan lengkung berasaskan komputer seperti pakar lengkung 1.3 atau ELISA Calc dalam model muat bukan linear 5 atau 4 parameter.

Prestasi

1. Sensitiviti:

had bawah pengesanan: ≤ 0.001pg/μL (untuk UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (untuk 5-OMe-UTP-dsRNA).

had bawah kuantiti:0.0156 pg/μL (untuk UTP-, pUTP-dsRNA),0.0312 pg/μL (untuk N1-Me-pUTP-dsRNA),0.0625 pg/μL (untuk 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Ketepatan: CV Intra-Assay ≤10%, CV Inter-Assay ≤10%

3. Pemulihan: 80%~120%

4.Kelinearan:0.0156-0.5pg/μL(untukUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(untukN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(untuk 5-OMe-UTP-dsRNA).

Pertimbangan

1. Suhu dan masa tindak balas TMB adalah kritikal, sila kawal mereka mengikut arahan dengan ketat.

2. Untuk mencapai kebolehulangan dan kepekaan ujian yang baik, pencucian plat yang betul untuk mengeluarkan lebihan reagen yang tidak bertindak balas adalah penting.

3. Semua reagen hendaklah dicampur dengan teliti sebelum digunakan dan elakkan bumble semasa sampel atau penambahan reagen.

4. Jika hablur telah terbentuk dalam penimbal pencuci pekat(20x), panaskan hingga 37℃ dan gaul perlahan-lahan sehingga hablur benar-benar larut.

5. Elakkan ujian sampel yang mengandungi Sodium Azide (NaN3), kerana ia boleh memusnahkan aktiviti HRP yang mengakibatkan anggaran rendah jumlah dsRNA.

6. Elakkan pencemaran RNase semasa ujian.

7. Standard/sampel, antibodi pengesanan dan SA-HRP juga boleh dijalankan di RT tanpa goncang, tetapi ini boleh menyebabkan sensitiviti pengesanan berkurangan sebanyak satu kali ganda.Untuk kes ini, kami mengesyorkan piawaian UTP dan pUTP dsRNA hendaklah dicairkan daripada 2pg/μL, piawaian dsRNA N1-Me-pUTP hendaklah dicairkan daripada 4pg/μL dan piawaian dsRNA 5-OMe-UTP hendaklah dicairkan daripada 8pg/μL.Di samping itu, eramkan larutan kerja HRP-streptavidin selama 60 minit pada suhu bilik.Jangan gunakan penggoncang kelalang, kerana penggoncang kelalang boleh mengakibatkan keputusan yang tidak tepat.

Hasil tipikal

1. Data lengkung piawai

2. Pengiraan lengkung piawai

3. Julat pengesanan pelapik:0.0312- 1pg/μL